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技术推介
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                  技术推介

                  技术干货|三代测序PacBio“双核”平台国内实测数据分析报告

                  相信“三代测序”这项技术对于很多专家、老师而言已不再陌生,甚至可以说有许多老师已是“浅尝辄止”亦或是正“跃跃欲试”。除了逐渐增多的各类商业宣传,这一良好的发展趋势更应归功于PacBio第一代平台RS及其升级版RSⅡ的稳定产出及持续性技术升级。在此良好基础上,经过一年多的漫长等待,第二代平台Sequel在今年上半年终于远渡重洋顺利抵达武汉,落户武汉生物技术研究院综合组学技术中心,与其前辈RSⅡ平台正式组成基因检测平台的“双核”系统,辅以全新的高性能计算集群与分析流程,整装待发为您提供更灵活更优质的科研选择。


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                     本着纸上得来终觉浅,绝知此事要躬行的态度,本篇希望通过一系列的实测及比对数据为各位老师提供关于三代测序技术的第一手资讯,进而协助大家在面对不同平台的需求时作出更合理的技术选择。

                     Sequel与RSⅡ平台在实现单分子测序时均采用了相同的SMRT(Single Molecular Real-Time)专利技术,其最大差别在于以下两点:RSⅡ与Sequel平台采用的单张SMRTCell芯片上含有的ZMW纳米孔数分别达到了15万及100万个。相比较RSⅡ,Sequel平台的理论测序通量提高了近7倍;Sequel采用了不同的光学系统及测序配套试剂,其运行难度、耗材成本比例以及数据产出表现与RSⅡ有一定差异。纳米孔的几何倍数提升并不意味着相同程度的成本与时间缩减(单碱基成本的大趋势是在降低,但没有达到断崖式下降的预期)。

                     自Sequel运行后,PacBio公司对该系统进行了多次试剂及软件升级(图一)。考虑到数据的成本比与实用性,本篇仅展示研究院采用了目前最新的V1.2.1版本试剂的测序分析结果。

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                  图一.早期V1.1版本试剂今年8月测试结果,通过优化实验条件,数据产量最高能达到7Gb/SMRTCell


                  实测比对一: 短片段文库双平台平行测试

                     测试文库平均长度:4kb(好吧,在三代测序领域4kb的平均长度已经算短片段文库了)

                     测试物种:某哺乳动物

                     测试目的:测试短片段文库在精准靶向分析、转录组分析、高复杂基因组分析中有广泛应用。在这些应用中测序数据读长(Polymerase reads)的重要性最高,因为更长的读长意味着更高的准确性和数据得率。

                  测试流程:基于PacBio官方的优化文库构建流程(读长优化方向)及上机测序流程。

                     RSⅡ平台:平行检测了2张SMRTCell芯片,结果显示平均读长(Polymerase reads)超过18kb,单张芯片数据产量在1.5-1.9Gb之间。

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                     对数据进行更为精确的二级分析后,所获得的Subreads分析结果如下:

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                     Sequel平台:相同文库平行检测1张SMRTCell芯片,平均读长(Polymerase reads)8.27kb,产量4.35Gb。

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                  对数据进行更为精确的二级分析后,所获得的Subreads分析结果如下:

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                     结果评析:目前,对于短片段文库,RSⅡ平台能获得明显更优的测序读长,这将极有利于PacBio数据的自我矫正(受读长的影响,两个平台的Subreads数据也存在1kb的长度差异);同时考虑到此类应用的数据需求量并不大,而RSⅡ平台不需要等待大量的样本同时上机,数据产出具备更好的灵活性与时效性。因此建议优先考虑在RSⅡ平台进行此类项目。

                  实测比对二: 20kb长片段文库双平台平行测试

                     测试文库平均长度:20kb

                     测试物种:某昆虫,gDNA质量偏低,存在降解问题

                     测试目的:测试长片段文库在复杂基因组组装、基因组补洞、结构变异分析等方面具有广泛应用。在这些应用中,测序数据Subreads的重要性最高,因为更长的Subreads意味着可以获得更好的组装结果。

                     测试流程:基于PacBio官方的优化文库构建流程(Sureads优化方向)及上机测序流程。

                     RSⅡ平台:检测了两张SMRTCell芯片,结果显示平均读长(Polymerase reads)为10.6kb,单张芯片数据产量968Mb,二级分析结果显示平均Subreads为9kb,Subreads N50为12kb。

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                     Sequel平台:相同文库平行检测1张SMRTCell芯片,平均读长(Polymerase reads)9.2kb,产量4.51Gb。二级分析结果显示平均Subreads为8kb,Subreads N50为11kb。

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                     结果评析:对于长片段文库,类似于本次测序的昆虫样本,测序数据质量往往受限于原始样本质量,尤其是植物、昆虫、真菌基因组的长片段文库(因此类样本的次生代谢物较多,基因组DNA长度和质量均不高,较难得到最优的测序数据)。两个平台的数据并没有达到理论最优值,RSⅡ平台暂时在测序读长和Subread上有一定的优势,但相比短片段数据,两个平台的数据差异并不大;同时考虑到此类应用的数据需求量一般较大,通过后续的文库构建与测序实验条件优化,Sequel平台的数据质量还有大幅度提升的潜力。因此建议对于组装不追求理论最优值、测序时间比较紧张的样本优先考虑在Sequel平台进行此类项目。

                      需要注意的是:组装效果最好的超长30kb文库目前还只能在RSⅡ平台上测序。以人类基因组为例,利用普通的20kb文库(如上述昆虫文库的质量)产出的数据进行de novo组装能获得的Contig N50在1-5Mb左右,高质量的20Kb文库产出数据能获得5-15Mb级别的Contig N50,高质量的30Kb文库产出数据能获得高达30Mb级别的Contig N50.

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                      同时,考虑到在Sequel单张芯片平台上进行文库测试的成本较高,对于基因组组装结果力求完美的项目,建议现在开始着手基因组提取与准备工作(图二),研究院也将提供样本30kb文库制备与RSⅡ平台测试工作,在RSⅡ平台上快速摸索到样本的理论最优值,再平移到Sequel平台上完成后续的大量数据产出工作,同时确保了数据产出的高质量与高速率。

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                  图二.样本提取质量差异,泳道1-高质量gDNA,泳道2-低质量gDNA. 根据研究院对于近百个实测样本的统计,90%的实验室自提样本最高只能达到泳道2的质量

                   

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                     武汉生物技术研究院位于东湖国家自主创新示范区武汉光谷生物城内,成立于2009年8月29日,由湖北省委、省政府整合武汉大学、华中科技大学、华中农业大学、中科院武汉分院等高校、科研院所的优势资源组建而成的新型的科研/产业型研究院,其下设立的技术平台部已搭建以第三代测序为核心的基因测序分析,生物质谱检测及分析,生物核磁分析及筛选,细胞分选及显微成像,细胞/化合物高通量筛选,高性能运算与生物信息分析,生物发酵及制备,蛋白纯化及晶体解析共计八大设备平台,以及以基因组学、转录组学、表观组学、蛋白组学、代谢组学为支撑的综合性组学技术中心。近四年来,累计服务全国超过400个企事业单位、高校、科研院所,年均检测样本数超过15000个,服务客户超30000人次。承担国家十一五,十二五重大新药创制科技重大专项,国家病毒病防治重大专项等多项重大课题。

                     武汉生物技术研究院位于东湖国家自主创新示范区武汉光谷生物城内,成立于2009年8月29日,由湖北省委、省政府整合武汉大学、华中科技大学、华中农业大学、中科院武汉分院等高校、科研院所的优势资源组建而成的新型的科研/产业型研究院,其下设立的技术平台部已搭建以第三代测序为核心的基因测序分析,生物质谱检测及分析,生物核磁分析及筛选,细胞分选及显微成像,细胞/化合物高通量筛选,高性能运算与生物信息分析,生物发酵及制备,蛋白纯化及晶体解析共计八大设备平台,以及以基因组学、转录组学、表观组学、蛋白组学、代谢组学为支撑的综合性组学技术中心。近四年来,累计服务全国超过400个企事业单位、高校、科研院所,年均检测样本数超过15000个,服务客户超30000人次。承担国家十一五,十二五重大新药创制科技重大专项,国家病毒病防治重大专项等多项重大课题。

                     基因测序平台自2012年运行至今,作为国内最早提供三代测序服务与相关技术合作的机构,现已形成以PacBio单分子测序RSII和Sequel“双核“平台为中心,NGS测序与Sanger测序为辅助,高性能运算与生物信息平台为依托的综合性平台,可全方位满足各种通量的测序需求。现已成功利用三代测序技术完成细菌、真菌、昆虫、动植物、人类等数百个物种的基因组、全长转录组测序及分析工作,并开发建立了基于三代测序技术的靶向测序、宏基因组测序、表观遗传测序、以及单细胞测序系列方案。平台秉承“开放”、“共享”、“双赢”原则,期望与各领域的专家合作,解决更多科研和临床研究中的难题。


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