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                  |突破进展|三代测序技术首个人类遗传病变异鉴定临床案例深入解读

                  作为三代测序技术的领头羊,自2010年PacBio公司在AGTB大会上推出其第一代测序平台RS以来,三代测序技术在备受关注与期望的同时也经常被一些科研工作者所质疑。直到2012年Jonas Korlach、Eric Schadt等专家在《Nature》系列杂志上连续发表了多篇使用三代测序数据完成微生物全基因组组装和碱基修饰分析的文章以后,人们才真正开始尝试这一革新性技术,并很快将其技术优势应用到动物、植物、人类等更大、更复杂的基因组及完整无偏的全长转录组分析中。在过去的3年里,武汉生物技术研究院作为国内首批引入三代测序平台的老牌综合性科研/服务机构,也非常有幸的共同发起完成了“华夏一号”——中国首个参考序列级别的黄种人基因组近完成图等近百个科研项目,全程经历鉴证了三代测序技术一路走来的各种艰辛与荣耀。时至今日,也许您认为完成更高质量的全基因组组装、获得精确的全长转录本信息就已是三代测序的极限,亦或是您正为三代测序公司为何能获得近亿元融资而惊叹,今天我们就通过一篇即将正式发表的文章来“管中窥豹”。

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                  PacBio单分子测序芯片发展史,依次从左至右为第一代RS平台芯片,第一代RSII平台芯片,第二代Sequel平台芯片


                  二代测序发展至今,科研领域的开疆拓土无疑为其开辟了一块肥沃的自留地,但真正让人“垂涎三尺”的应该是临床应用这颗仙豆在这块自留地上生长结出的硕果,近年来辅以精准医疗的春风吹拂,果香四溢,整个园子好不热闹。可以预见三代测序技术也将经历类似的发展路径,这不第一篇成功利用三代测序技术进行人类全基因组测序进而鉴定致病性基因结构突变的文章已经出炉。

                  该文出自斯坦福大学的Euan Ashley教授,相信了解美国精准医疗的老师对这位大牛一定不陌生。现如今二代测序技术可以便捷准确的检测基因组上的单碱基变异,但在串联重复序列、高GC/AT区域、高多态性/高同源性区域的检测仍有些力不从心,而三代测序技术则能帮助人们研究这些以往被忽视的“人类基因组蓝海”。Ashley教授团队选择了一位疑似Carney综合征患者作为研究对象。该患者出生时表现出了一定的呼吸问题,7岁时首次发现心脏黏液瘤,随后予以切除,10岁时诊断出睾丸肿块,13岁时则发现患有垂体瘤,18岁时再次切除了复发的心脏粘液瘤。此时,患者被怀疑患有Carney综合征,但临床PRKAR1A基因突变检测显示为阴性。2016年,患者在准备进行心脏移植时,医生团队第二次进行了全基因组测序分子诊断。此次检测使用Illumina HiSeq 2500平台完成,平均测序深度36×,数据分析由斯坦福大学(Stanford Medicine Clinical Genomics Service)完成,但此次分析也没有检测出任何可以解释患者临床表征的遗传变异(图一)。

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                  图一  患者病史和三维胸部超声心脏黏液瘤影像。

                  (A)患者发病情况概述   (B)左心室2×3cm黏液瘤   (C)不同角度的粘液瘤影像。




                  随后,为了探究潜在的致病因素,研究人员对该患者进行了全基因组的三代测序检测。测序使用了最新的Sequel测序平台,一共获得26.7Gb可用数据(合计430万条序列,读长N50达到9614bp),约8.6X全基因组覆盖深度。通过与参考基因组比对,Ashley教授利用这些数据在患者的基因组上分别找到了6971和6821个长度大于50bp的缺失和插入突变。

                    为了进一步挖掘结构变异中的致病因素,Ashley教授对所获得的突变数据集进行了进一步的筛选,如去除明显对功能没有影响的突变,重点关注位于外显子区域的突变,最终将突变集缩减到20个缺失与16个插入突变。其中分别有3个缺失与3个插入突变与人类孟德尔遗传病数据库中的遗传疾病相关联(图二)。

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                        图二 致病性突变筛选过程




                  随后,结合该患者的临床症状,Ashley教授通过手工方式对这6个突变区域进行了重点分析,并且成功鉴定到染色体上存在的一处杂合性缺失,该缺失完全移除了PRKAR1A基因 (NM_212472.2)的第一个外显子。在生殖细胞中,该基因的突变会导致Carney综合征(Carney complex,一种常染色体显性遗传病)。从数据比对结果可以看出,1/2的三代数据能这支持这一缺失现象(图三)。

                   

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                   图三 杂合性变异位点的鉴定


                  为了确认这一发现,Ashley教授使用Sanger测序对疑似缺失的区域进行了验证,结果再次证实了这一杂合性缺失的存在且三代数据精确的定位了该缺失区域的断点位置(图四)。

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                    图四Sanger测序验证缺失变异及断点位置




                      展望未来,基因突变检测的敏感性与特异性对于临床检验至关重要,而二代测序短片段数据较难同时顾及这两个方面,尤其是对于结构变异的鉴定。在利用三代数据明确了少数的候选基因或准确的断点信息的情况下,人们回溯性的再次利用二代短片段数据进行分析,能更好的发现这些原本被遗漏的结构性变异(图五)。

                   

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                  图五 二代测序数据回溯性分析


                  临床上迫切需要得到精准且完整的变异信息,而仅利用短片段数据可能会遗漏高达80%的结构变异信息(引自《Nature》doi:10.1038/nature13907)。三代测序技术产生的长片段数据不仅能弥补这些被遗漏的极具价值的“蓝海信息”,还能在相对较低的基因组覆盖丰度下完成这一工作。在可以预见的未来,随着三代测序技术的进一步成熟,数据的读长和精确性还将持续提升,相信该技术将会更广泛的被应用于临床检测及诊断领域,如检测更复杂的染色体结构变异区域、肠道菌群与致病性关系、病毒/细菌耐药性监测、HLA分型、癌症等疾病相关基因/转录本精细研究等。同时,新Sequel平台带来的更大通量将会进一步引发三代测序的科研普及化与临床应用化。


                  原文链接:http://dx.doi.org/10.1101/090985 Long-read whole genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease


                   


                       

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                        武汉生物技术研究院位于东湖国家自主创新示范区武汉光谷生物城内,成立于2009年8月29日,由湖北省委、省政府整合武汉大学、华中科技大学、华中农业大学、中科院武汉分院等高校、科研院所的优势资源组建而成的新型的科研/产业型研究院,其下设立的技术平台部已搭建以第三代测序为核心的基因测序分析,生物质谱检测及分析,生物核磁分析及筛选,细胞分选及显微成像,细胞/化合物高通量筛选,高性能运算与生物信息分析,生物发酵及制备,蛋白纯化及晶体解析共计八大设备平台,以及以基因组学、转录组学、表观组学、蛋白组学、代谢组学为支撑的综合性组学技术中心。近四年来,累计服务全国超过400个企事业单位、高校、科研院所,年均检测样本数超过15000个,服务客户超30000人次。承担国家十一五,十二五重大新药创制科技重大专项,国家病毒病防治重大专项等多项重大课题。

                  基因测序平台自2012年运行至今,作为国内最早提供三代测序服务与相关技术合作的机构,现已形成以PacBio单分子测序RSII和Sequel“双核“平台为中心,NGS测序与Sanger测序为辅助,高性能运算与生物信息平台为依托的综合性平台,可全方位满足各种通量的测序需求。现已成功利用三代测序技术完成细菌、真菌、昆虫、动植物、人类等数百个物种的基因组、全长转录组测序及分析工作,并开发建立了基于三代测序技术的靶向测序、宏基因组测序、表观遗传测序、以及单细胞测序系列方案。平台秉承“开放”、“共享”、“双赢”原则,期望与各领域的专家合作,解决更多科研和临床研究中的难题。


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